Identification of novel functional domains of Rad52 in Saccharomyces cerevisiae

Reparation af DNA dobbeltstrengsbrud (DSB) er vigtig for opretholdelse af genetisk stabilitet. Manglende eller fejlagtig reparation af DNA DSB medfører genetisk ustabilitet, hvilket i højere eukaryoter kan føre til kræftudvikling. DNA DSB repareres blandt andet ved hjælp af homolog rekombination, som er den foretrukne reparationsmekanisme i bagegæren Saccharomyces cerevisiae, som derfor ofte anvendes som modelorganisme til at studere homolog rekombination.

Reparationsvejen homolog rekombination, samt mange af de proteiner der virker i denne, er evolutionært bevaret fra gær til menneske. S. cerevisiae er desuden nem at manipulere genetisk og der eksisterer sofistikerede in vivo assays som muliggør visualisering af reparationsprocessen ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Rad52 er et vigtigt protein til reparation af DNA DSB i S. cerevisiae og rad52Δ celler har en alvorlig fænotype med langsom vækst og sensitivitet overfor MMS, som inducerer DNA DSB. Den primære struktur samt væsentlige biokemiske funktioner af Rad52 er evolutionært bevaret og det er derfor muligt at overføre viden om Rad52 fra gærceller til mammale celler.

Det er tidligere vist, at Rad52 og andre DNA reparationsproteiner akkumulerer i cellekernen som følge af DNA-skade. De høje koncentrationer af reparationsproteiner udgør reparationscentre, hvor flere DNA-skader bliver repareret på én gang. Det er dog endnu uvist, hvordan Rad52 proteinet kommer ind i cellekernen, da der ikke tidligere er blevet påvist et nukleært lokalisationssignal i proteinsekvensen.

Ligeledes er det uvist, hvilke mekanismer der styrer akkumulering af Rad52 i reparationscentre som følge af DNA DSB. Det er det primære formål med dette studie at undersøge, hvorledes Rad52 kommer til cellekernen efter translation og inkorporeres i reparationscentre ved DNA DSB. I det første studie undersøges, hvordan Rad52 transporteres til cellekernen.

En række trunkerede samt internt deleterede rad52 alleller er fusioneret med GFP og de resulterende fusionsproteiner analyseres ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at bestemme den cellulære distribuering af proteinerne. Resultater fra disse forsøg peger på et område i midten af proteinsekvensen af Rad52 som værende vigtig for nukleær lokalisering af Rad52.

En efterfølgende sekvensanalyse af området tyder også på tilstedeværelsen af en NLS sekvens i midten af Rad52 sekvensen. For at eksaminere området nærmere udskiftes aminosyrerester i den formodede NLS sekvens med alanin, hvorefter den cellulære lokalisering af det resulterende protein eksamineres. Alanin-substitueringen hindrer Rad52 mutantproteinet i at komme ind i cellekernen og det forbliver i stedet i cytosolet.

Når det fejlsorterende protein forlænges med en kendt NLS sekvens fra SV40 virus translokeres proteinet til cellekernen og viser sig at være funktionelt idet celler, som udtrykker det NLS-mærkede Rad52 protein, er i stand til at reparere inducerede DNA-skader. Disse resultater tyder på, at der i midten af Rad52 proteinsekvensen er en hidtil ukendt NLS, som er involveret i nukleær transport af Rad52.

I det næste studie undersøges om der eksisterer en specifik region i Rad52 proteinet, som er ansvarlig for inkorporering af Rad52 i reparationscentre som følge af DNA skader. En række Rad52 mutanter konstrueres, som er forkortede fra C-terminalen og ydermere alle er mærkede med GFP. De muterede fusionsproteiner eksamineres in vivo med fluorescensmikroskopi og flere Rad52 mutantproteiner identificeres, som er ude af stand til at blive inkorporeret i et reparationscenter.

En yderligere finmapning peger på et område af Rad52 som værende involveret i Rad52s koncentration i reparationscentre. Der udvælges en mutant til videre analyse. Mutationen består af en aminosyresubstitution af fire aminosyrerester med alanin og det resulterende protein er ikke i stand til at danne reparationscentre, hverken spontant i S-fase eller som følge af MMS behandling.

Ydermere er stammen, som udtrykker mutantproteinet, meget sensitiv overfor MMS behandling, hvilket indikerer at den muterede stamme er ude af stand til at reparere skader som er opstået efter behandling med MMS. Det muterede protein oprenses og karakteriseres ved biokemiske analyser. Disse viser, at ingen kendte Rad52 funktioner såsom evnen til binde DNA, anneale enkeltstrenget DNA og oligomerisere til ringstrukturer ser ud til at være påvirket at mutationen.

Endeligt undersøges den biologiske funktion af den C-terminale del af Rad52, som for nyligt har vist sig at indeholde et nyt DNA-bindende domæne. Rad52 mutantproteiner, som kun udtrykker den C-terminale del af Rad52, binder enkeltstrenget og dobbeltstrenget DNA in vitro, ligesom det er i stand til at katalysere Rad51-medieret strand-exchange.

Her undersøges om trunkerede Rad52 proteiner også har en biologisk funktion in vivo. Rad52 proteiner, der kun udtrykker midten og den C-terminale del eller kun den C-terminale del af Rad52, mærkes med en NLS sekvens for at sikre nukleær lokalisering samt med GFP for at muliggøre detektion ved fluorescensmikroskopi.

Dernæst udtrykkes proteinerne i enten rad52Δ eller rad52Δ327 stammer og analyseres i et MMS spot assay. Disse assay viser, at de trunkerede proteiner til en vis grad er i stand til at komplementere rad52Δ og i højere grad rad52Δ327. De trunkerede proteiner undersøges også for deres evne til at blive inkorporeret i reparationscentre efter MMS-behandling, hvilket ikke var muligt at observere under de givne betingelser.

Ovennævnte studie præsenterer for første gang tilstedeværelsen af tre nye funktionelle domæner i S. cerevisiae Rad52. Det understreger vigtigheden af Rad52, dette multifunktionelle protein i homolog rekombination og giver ny forståelse for en reparationsmekanisme, som er så vigtig for opretholdelse af genetisk stabilitet.