Development of a novel concept for performing multiple assays on clinical samples using fluidic device

MikroRNA (miRNA) er små ikke kodende RNA stykker, der er involveret i post-transkriptionel regulering af gen-ekspression. Ekspressionen af specifikke miRNAer er reguleret i forskellige kræftformer og kan derfor betragtes som nye biomarkører, der kan bruges til klassifikation og mulig diagnostik. Nye histologiske teknikker som er mere følsomme og i stand til at detekterer multiple miRNAer samtidigt eller i kombination med protein biomarkører, anses for at være nødvendige i udviklingen af nye diagnostiske analyser.

På trods af disse lovende udsigter har implementering af miRNA detektion i eksisterende histologiske teknikker vist sig at være problematiske. Udviklingen af locked nukleinsyre (LNA) prober med høj affinitet for miRNA har muliggjort in situ detektion i forskellige typer af væv. Begrænset følsomhed i sådanne teknikker kan dog forhindre detektion af meget lavt udtrykte miRNAer.

Dette kan være forårsaget af utilstrækkelig masse transport af reagenser ved inkubering med konventionel teknikker, da disse er hæmmet af diffusion. Til løsning af disse problemstillinger er der i dette studie fremsat to modeller. Den første model involverede udvikling af teknikker med øget følsomhed for in situ detektion af miRNAer.

Disse teknikker blev udført med prober bestående af 2’O-Methyl-RNA og LNA i en optimeret, giftfri buffer, hvor uspecifik RNA var udeladt. Den optimerede teknik gav højere følsomhed i detektion af fem ud af otte miRNAer, samt muliggjorde detektion af den lavt udtrykte miRNA-130a sammenlignet med konventionelle teknikker, hvor der benyttes prober af DNA og LNA.

Desuden kunne multiple miRNAer detekteres ved brug af sekventielle inkuberinger af TSA reagens. Dette tillod detektion af to miRNA og et protein på samme vævssnit. Den anden model involverede design og konstruktion af en mikrofluid enhed, som blev betegnet HistoFlex. HistoFlex tillader automatiseret og sekventiel indsprøjtning af reagenser i reaktionskamre, der er reversibelt forseglet til objektglas med immobiliserede biologiske prøver.

Der blev dokumenteret ensartede reaktionsbetingelser overalt i kamrene under optimerede væskebetingelser. Dette medførte en reduktion i den variation der blev observeret fra analyse til analyse med op til en faktor fire. Endvidere blev automatiseret in situ detektion af miRNA udført i HistoFlex enheden.

Dette medførte øget detektionsfølsomhed og to fold reduktion af analysetiden sammenlignet med konventionelle teknikker. De to løsningsmodeller har vist sig at muliggøre udførelse af følsomme, multiple analyser for in situ detektion af biomarkører i vævssnit. Dette har potentielt relevans indenfor udvikling og implementering af diagnostiske analyser.