Production, purification and structural characterisation of recombinant barley limit dextrinase and characterisation of its interaction with the endogenous limit dextrinase inhibitor

Heterolog produktion af store multidomæne proteiner fra højere planter er ofte besværlig. Byg limit dextrinase (LD), som er et 98 kDa stort multidomæne stivelses og grænsedextrin afgreningsenzym, spiller en væsentlig rolle i stivelsesmobilisering under frøspiring og er muligvis også involveret i stivelse biosyntesen ved trimning af intermediære forgrenede α-glucan strukturer.

Endvidere spiller LD en vigtig rolle ved nedbrydning af grænsedextriner i ølproduktion. LD isoleret fra spirende byg frø er fundet i en "bundet" inaktiv form, og en fri enzymatisk aktiv form. Den inaktive LD form blev foreslået til at bestå af et kompleks med den endogene limit dextrinase hæmmer (LDI) og isolering under reducerende forhold resulterede i enzymatisk fuldt aktivt LD.

Tilstedeværelsen af LDI under ølproduktion menes at bidrage til en væsentlig reduktion i det teoretiske opnåelige ethanol indhold. Enzymatisk aktivet byg LD og inhibitorisk aktivt LDI blevet fremstillet ved sekretorisk ekspression ved en fermentering af Pichia pastoris med høj celledensitets. Generne som koder for henholdsvis LD og LDI (uden nativt signal peptid) blev subklonet in-frame med Saccharomyces cerevisiae -faktor sekretion signalet ind i P. pastoris ekspression vektor under kontrol af alkohol oxidase 1 promotoren.

Optimering af en fed-batch fermentering procedure efterfulgt af affinitetskromatografi og gelfiltrering (LD) eller anionbytning (LDI) resulterede i gode udbytter af både LD og LDI. Kinetiske konstanter for LD katalyseret pullulan hydrolyse blev bestemt ved anvendelse af Michealis-Menten ligningen for ikke-konkurrencedygtige substrat hæmning, hvilket afspejler en væsentlig substrat-hæmning og/eller transglycosylation.

Bindings kinetik og energetik af LD med LDI vildtype og N-terminal forlængede eller trunkerede varianter af LDI produceret i P. pastoris, blev bestemt ved hjælp af surface plasmon resonance (SPR) analyse. Anvendelse af en 1:1-bindingsmodel til de generede SPR data viste en høj bindingsaffinitet med KD i det subnanomolære område ved pH 6,0, 150 mM NaCl og 25 °C.

Endvidere viste SPR dataene at KD var pH –afhængig primært pga. en forøgelse af dissociationshastigheden ved ændring af pH-værdien fra den optimale, pH=6,5. Undersøgelse af LD/LDI interaktionen ved forskellige ionstyrker viste at elektrostatiske kræfter ikke synes at bidrage væsentligt til LD/LDI stabiliteten. van't Hoff parametrene blev beregnet ud fra KD værdierne i temperaturintervallet 10-35 °C.

Favorable enthalpi- og entropi-værdier indikerede at begge komponenter bidrog til kompleksdannelsen og resulterede i en bindings fri energi, ΔG° = - 57 kJ/mol. N-terminalt forlængede eller trunkerede LDI mutanter ledte kun til en marginal ændring af KD, hvilket indikerer at den N-terminale sekvens af vildtype LDI ikke er afgørende for binding til LD.

Krystalstrukturerne af LD i kompleks med de kompetitive inhibitorer α- og β-CD er blevet forfinet til hhv. 2,5 Å og 2,1 Å. Strukturen af LD er den første krystalstruktur i verden af en plante limit dextrinase. Cyclodextrinerne er observeret ved det forventede bindingssted for den primære kulhydrat kæde og okkuperer aglycon subsite +1 og +2.

Ny indsigt i substrat specifikke afgørende faktorer og den mulige rolle i stivelse biosyntesen er belyst ved hjælp af denne første struktur af en plante limit dextrinase. De unikke ekspression systemer som her er etableret for både byg LD og LDI åbner op for mulighederne med videre karakterisering af interaktionen mellem LD og LDI.

Baseret på denne karakterisering såvel som på den første struktur af en plante limit dextrinase, kan der foretages ”protein engineering” af LD og/eller LDI, som resulterer i en ændret/nedsat inhibering af LD. Det vil give mulighed for en ølproduktion med bedre udnyttelse af byggen og resulterer i et højere ethanol indhold.